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纳米氢氧化镁对茶叶黑斑病原真菌活性的抑制效果

添加时间:2019-08-05 10:39 来源:未知 作者:优选论文网
  摘要:茶叶真菌病害是引起茶叶减产的重要原因之一, 纳米材料作为环境友好型抗菌材料可应用于抑制茶叶真菌病害。本研究通过共沉淀法合成纳米氢氧化镁 (nano-Mg (OH) 2) , 研究其抑制茶叶黑斑病原真菌的效果。采用X-射线粉末衍 (X-ray powder diffraction, XRD) 表征nano-Mg (OH) 2的尺寸, 通过谢乐公式计算得出合成的纳米颗粒在 (101) 面的尺寸为14.5 nm.利用扫描电镜 (scanning electron microscope, SEM) 对nano-Mg (OH) 2的形貌进行观察, 发现纳米颗粒结构呈规则的片状。对茶叶黑斑病原真菌进行分离纯化, 通过形态学观测、核糖体DNA内转录间区 (internal transcribed spacer, ITS) 序列分析、ITS区特异性引物PCR检测和系统发育关系比较, 确定分离的病原菌为芒果球座菌 (Guignardia mangiferae) , 茶叶上此类真菌的报道较少。采用平板涂布的方法, 以空白对照和阳性对照 (碱性条件) 为对照组, 以不同浓度nano-Mg (OH) 2为实验组, 经培养一段时间后通过十字交叉法测量真菌生长直径并计算抑制率。结果表明, nano-Mg (OH) 2能有效的抑制茶叶真菌的生长, 5 mg/mL nano-Mg (OH) 2在3 d时对菌丝生长抑制率可达48.78%, 随着浓度增加效果更为显着, 50 mg/mL nano-Mg (OH) 2对菌丝生长有100%的抑制率, 半最大效应浓度 (half maximal effective concentration, EC50) 为7.63 mg/mL.研究结果可为后续研发安全、有效的纳米制剂提供科学依据和技术支持。
  
  关键词:纳米氢氧化镁; 茶叶黑斑病; 抑制真菌;
 
  
  茶树 (Camellia sinensis) 是一种山茶科的灌木植物, 是我国的重要经济作物。茶叶真菌病害较为普遍, 受真菌侵染造成产量下降、质量不佳。已有报道茶叶病害有30多种, 其中最常见有茶白星病、茶炭疽病、茶圆赤星病、茶云纹叶枯病等 (叶丽娟, 2006;赵晓珍, 2017) .此外, 对于芒果球座菌 (Guignardia mangiferae) 引起植物病害, 近年来报道的有番石榴 (Psidium guajava) 黑斑病、香蕉 (Citrus reticulata) 黑斑病、柑橘 (Musa paradisiaca) 黑斑病等, 当前对茶叶黑斑病少有报道 (孙嘉曼等, 2016) .目前防治茶叶真菌病害的药剂以化学药剂为主, 化学药剂的施用对环境的负面影响较大, 且容易在茶叶上造成农药残留, 不利于控制药残和生态茶园的建设 (尤志明等, 2017) .因而如何制定茶园病害绿色防控技术是当前中国茶叶产业实现持续、稳定和健康的国际化发展战略的关键。随着科技的进步, 纳米材料可以作为新型的杀菌剂和杀虫剂, 已逐渐应用在植物保护领域。纳米材料具有表面和界面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应和宏观效应等超常特性, 在在农业不同领域都有广泛的应用 (Iavicoli et al., 2017;Kim et al., 2018) .与传统无机抗菌剂相比, 纳米杀菌剂更具优良的抗菌效果。
  
  本研究从茶叶危害状部位分离病菌, 经形态特征与分子鉴定结果, 确定分离的菌株为黑斑病菌。采用共沉淀法制备纳米氢氧化镁 (nano-Mg (OH) 2) , 利用X-射线粉末衍射 (X-ray powder diffraction, XRD) 和扫描电镜 (scanning electron microscope, SEM) 对制备的nano-Mg (OH) 2的尺寸和形貌进行表征, 研究Mg (OH) 2对黑斑病菌的抑制作用, 以期为纳米制剂防治茶叶真菌病害提供科学理论依据。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 材料
  
  1.1.1 病叶样品
  
  于2018年10月从福建农林大学茶园采集茶树 (Camellia sinensis) 病叶。
  
  1.1.2 培养基
  
  PDA固体培养基:煮沸成泥马铃薯200 g, 纱布过滤后加入20 g葡萄糖、20 g琼脂, 定容至1 000mL, 高压蒸汽灭菌 (于丽波等, 2016) .
  
  1.2 方法
  
  1.2.1 茶叶病原真菌的分离培养和保存
  
  采取病叶, 选取带有圆形稍凹陷的黑色病斑黑色小点零散于病斑的叶片, 病斑边缘呈黄褐色晕圈。消毒清洗叶片表面后, 于病健交界处剪取大小5 mm×2 mm的叶片, 酒精浸泡1~2 s, 5%次氯酸钠溶液浸泡5 min, 漂洗3次 (赵晓珍, 2017) .将处理过的叶片组织以三角形排列方式置于培养皿, 24~28℃培养, 待长满菌丝。边缘处打孔置于培养皿中央, 培养一周左右后于4℃保存备用。
  
  1.2.2 病原菌的形态特征
  
  采用接菌针将黑斑病原菌丝划线于PDA培养基上, 产孢后挑取病原菌经制片、压片, 在光学显微镜下对黑斑病菌的菌落的大小、颜色、形态等记录分析, 根据《真菌鉴定手册》 (魏景超编着, 上海科学技术出版社, 1979) 进行初步鉴定。
  
  1.2.3 病原菌的分子水平鉴定
  
  通过十六烷基三甲基溴化胺 (cetyl-trimehtylammonium bromide, CTAB) 法提取DNA, 刮取适量菌丝加入0.2 g石英砂和100μL CTAB, 65℃水浴加热1 h.加入1∶1体积的氯仿∶异戊醇, 离心后提取上清加入等体积的氯仿∶异戊醇, 重复操作。取上清加入2/3上清液体积的异戊醇 (-20℃) , -20℃下静置过夜。离心弃上清, 70%乙醇 (-20℃预冷) 清洗, 待乙醇蒸发后加入60μL ddH2O, 溶解后置于-20℃下备用 (罗金水等, 2018) .
  
  核糖体DNA内转录间隔区 (internal transcribed spacer, ITS) 序列可用于对真菌菌株的种属进行分类鉴定, 是探究植物种间关系的有效手段。因此, 利用引物ITS对病原菌株的基因组DNA进行PCR扩增。 (罗金水等, 2018;王兴红, 2012) , 反应体系 (25μL) :ddH2O 9.5μL;ITS4 (0.96 nmol/μL) 1μL, ITS5 (1.40 nmol/μL) 1μL;Taq DNA聚合酶mix12.5μL;DNA模板1μL.反应程序:95℃预变性10 min;95℃变性15 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸15s, 35次循环;最后72℃延伸7 min.取2.5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送至福州铂尚生物技术有限公司公司测序。所得测序结果在GenBank数据库进行BLAST序列比对, 确定属、种相似的菌株序列, 用邻接法构建系统进化树。
  
  1.2.4 纳米氢氧化镁合成和表征
  
  利用MgCl2·6H2O和NaOH作用生成沉淀来合成nano-Mg (OH) 2.7 g MgCl2·6H2O加10 mL ddH2O搅拌溶解;2.76 g NaOH加10 mL ddH2O搅拌溶解。将NaOH溶液均匀滴入MgCl2·6H2O溶液中, 搅拌过夜。以10 000 r/min离心5 min后取沉淀, 洗涤3次, 离心, 干燥研磨。使用XRD和SEM对nano-Mg (OH) 2尺寸和形貌进行观察和分析, 通过谢乐 (Scherrer) 公式计算得出合成的纳米颗粒的尺寸。
  
  1.2.5 纳米氢氧化镁抑制真菌实验
  
  采用平板涂布的方法进行抗真菌实验。分别配制5、25和50 mg/mL的nano-Mg (OH) 2水溶液, 并用超声清洗仪超声40 min, 备用。在PDA培养基中央注上100μL nano-Mg (OH) 2水溶液, 涂布均匀, 晾干后在平板中部接上真菌。以不加任何物质的PDA平板作为空白对照, 以pH=11的NaOH作为阳性对照, 各浓度的nano-Mg (OH) 2溶液为实验组, 进行重复实验。将培养皿倒置于26℃恒温箱继续培养3~7 d后, 以十字交叉法测量真菌的直径 (钟灵珅, 2018) , 观察真菌的生长情况。此外, 根据公式I=[ (C-E) /C]×100%计算抑制率, 其中I为nano-Mg (OH) 2对黑斑病菌的抑制率 (%) , C和E分别为空白组菌落直径和实验组菌落直径 (cm) .记录数据并计算出EC50.
  
  2 结果与分析
  
  2.1 纳米氢氧化镁的表征
  
  采用XRD对nano-Mg (OH) 2的尺寸进行计算, 并利用SEM对其形貌进行观察。结果表明, 通过共沉淀法合成的Mg (OH) 2与标准数据库卡片 (J国际衍射数据中心ICDD, http://www.ccrs.net.cn/ICDD/, PDF-2数据库, No.044-1482) 的特征峰完全吻合, 通过谢乐公式得出nano-Mg (OH) 2在 (101) 面的尺寸约为14.5 nm (图1A) , 且合成的nano-Mg (OH) 2呈较为规则的片状结构, 有一定的团聚行为 (图1B) .
  
  图1 纳米Mg (OH) 2的XRD分析 (A) 和SEM成像 (B)

  
  图2 病原菌的培养特征

  
  2.2 病菌株的鉴定
  
  2.2.1 病原菌的形态学特征
  
  分离的病原菌 (菌株编号:FAFU20181029) 在PDA培养基上菌丝初为灰白色, 经一段时间后菌丝致密, 菌丝絮状平铺生长, 菌落呈黑橄榄色, 表面带有黑色小粒子, 菌落边缘呈橄榄色, 边缘凹陷且平整, 背面呈黑色 (图2A) .在显微镜下观察分生孢子, 未成熟孢子由端部向基部变窄, 成熟孢子为单胞, 呈圆形, 无色透明 (图2B, 2C) .
  
  2.2.2 病原菌的分子生物鉴定
  
  采用CTAB法提取DNA, 以引物ITS对黑斑病菌株的基因组进行PCR扩增, 随后以1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的黑斑病菌DNA.凝胶电泳图中目的条带单一且清晰 (图3) , 表明菌株DNA提取成功。所送测序的PCR产物的测序结果在GenBank数据库进行BLAST序列比对, 选择与数据库中属、种相识度较高的菌株序列, 确定菌株属、种, 用邻接法构建系统进化树, 结果表明该菌株在进化树上归属于芒果球座菌 (图4) .
  
  图3 基因组DNA电泳图
  
  
  图4 基于ITS序列分析得到的NJ-系统树

  
  2.3 纳米氢氧化镁对茶叶黑斑病原菌的抑制作用
  
  用5、25和50 mg/mL的nano-Mg (OH) 2溶液均匀涂布在PDA培养基上, 将黑斑病菌接在培养基中部。观察发现, nano-Mg (OH) 2对黑斑病菌的生长具有较高的抑制作用, 与空白组相比, 在含nanoMg (OH) 2PDA平板上生长的黑斑病菌生长直径明显减少, 且随着nano-Mg (OH) 2浓度的增加, 黑斑病菌生长的直径也随着减少, 菌落与培养基的紧贴程度变小, 出现透明圈 (图5) .经计算, 3 d时5 mg/mL nano-Mg (OH) 2对菌丝生长抑制率可达48.78%, 50 mg/mL的nano-Mg (OH) 2对菌丝的抑制率为100% (表1) , 且EC50为7.63 mg/mL.此外, 由于nano-Mg (OH) 2呈碱性, 为了进一步验证碱性对黑斑病菌生长抑制是否有影响, 因而设置了碱性条件 (pH=11的NaOH溶液) 为阳性对照, 涂布平板后接上真菌。结果表明, 碱性条件下与空白对照的黑斑病菌生长差异小, 说明碱性对黑斑病菌生长没有明显的影响, 是nano-Mg (OH) 2自身对黑斑病原菌有很强的抑制作用。
  
  图5 黑斑病原菌分别与不同浓度的纳米氢氧化镁作用3~7 d后的平板图

  
  表1 nano-Mg (OH) 2对黑斑病原菌的抑菌率

  
  3 讨论
  
  当前随着高效、选择性强的杀菌剂被广泛得应用, 植物病原菌对杀菌剂的抗药性越来越严重。相对于有机、天然类抗菌剂而言, 无机纳米材料具有抗菌性、毒性低, 对环境生态和人类健康的危害小, 且具有耐热性以及病原菌不容易产生抗性等优点 (饶文华等, 2018) .因此, 纳米材料可以作为环境友好型的抗菌剂。已有研究表明, 纳米SiO2对小麦 (Triticum aestivum) 白粉病具有很好的抑制效果, 抑制率高于80% (王荔军等, 2001) .而光降解性型的纳米TiO2对烟草青枯菌 (Pseudomonas solanacearum) 的抑制率可达90% (蒲丽等, 2005) , 且TiO2溶胶材料具有广谱、高效的抗植物病原菌的能力, 在12 h对黄瓜 (Cucumis sativus) 细菌性角斑病菌、番茄 (Lycopersicon esculentum) 疮痴病菌、禾谷巨大芽胞杆菌 (Bacillus megaterium pv.cerealis) 、茄假单胞菌 (pseudomonas solanacearum) 和水稻白叶枯菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae) 的抗菌率均达到100% (李玲玲, 2007) .
  
  然而, 由于纳米材料本身对生物体具有一定的毒性 (Sharifi et al., 2012) , 因而在选择纳米材料作为抗真菌制剂时, 应该重点关注其环境安全性。nano-Mg (OH) 2作为安全、对环境无污染的绿色安全水处理剂, 对人体细胞和生物体均无明显的毒性 (Zhang et al., 2014;李春辉, 2013) , 在环境和实际生活中已被广泛地应用 (林璋等, 2014) .此外, 与其他纳米材料相比, nano-Mg (OH) 2的来源简单且成本低, 因而可以作为绿色环保低成本的纳米抗菌剂。
  
  从茶叶危害状分离得到的病原菌, 经形态观察和分子鉴定, 为黑斑病原菌:芒果球座菌。芒果球座菌引起的黑斑病出现在茶叶叶片上, 病斑逐渐扩大严重影响茶叶品质和经济价值 (张慧丽等, 2011) .本研究用MgCl2·6H2O和NaOH共沉淀法合成nano-Mg (OH) 2, 研究其对茶叶黑斑病菌的抑制作用。结果表明, nano-Mg (OH) 2的浓度与抑制率呈正相关, 浓度越高抑制率越大。而前期的研究也证实纳米材料的抗菌效果主要取决于材料的形貌、浓度、表面电荷等理化性质。在纳米材料抗菌机理上, 一般认为有活性氧 (reactive oxygen species ROS) 抗菌机理、金属离子溶出抗菌机理和接触型灭菌机理三种, 而nano-Mg (OH) 2对茶叶黑斑病原菌的抗菌机理还有待进一步的深入研究。本研究可为今后将nano-Mg (OH) 2应用于茶叶病原菌的防治提供理论基础和技术支持。
  
  4 结论
  
  本研究采用nano-Mg (OH) 2对茶叶黑斑病原真菌的抑制作用。采用XRD和SEM对所合成的nano-Mg (OH) 2的尺寸和形貌进行表征, 对茶叶危害状分离得到的病原菌进行分子生物学鉴定。结果表明, 分离得到的茶叶病原菌为芒果球座菌, nanoMg (OH) 2对其具有很强的抑制作用, 且nano-Mg (OH) 2的浓度越高抑制效果越好, 且nano-Mg (OH) 2对病原菌的抑制作用并非其碱性导致, 而是自身的抑制效应。
  
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