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转甜高粱角蛋白HTV基因拟南芥的抗盐能力探究

添加时间:2019-06-14 10:53 来源:未知 作者:优选论文网
  摘要:本研究从甜高粱耐盐自交系M-81E中分离出角蛋白HTV (hornerin transcript variant) 基因, 我们构建了pROKII-GFP-SbHTV融合表达载体对SbHTV进行亚细胞定位分析, 表明该基因编码的蛋白定位于细胞核。将该基因构建过表达载体, 转入到野生型拟南芥中获得纯合过表达株系, 并筛选出了拟南芥HTV的T-DNA插入纯合突变体。通过测定和分析盐处理下拟南芥野生型、过表达和突变体株系在萌发期、苗期的各项生理指标, 我们发现当用100mM NaCl处理时, 拟南芥各个株系的萌发率和根长都出现了显着差异, 突变体的根长要显着长于野生型, 过表达株系的根长要显着小于野生型。并且用100mM NaCl处理后, 突变体株系生物量积累的抑制程度明显低于野生型, 而过表达株系受抑制的程度要明显高于野生型。这表明SbHTV的过量表达降低植物的抗盐能力, 而敲除该基因有利于提高植物抗盐性, 初步阐明该基因在植物抗盐方面的作用。
  
  关键词:甜高粱; 角蛋白基因; 盐胁迫; 功能分析;
 
  
  0 引言
  
  角蛋白是一种结构蛋白质, 广泛存在于人和动物的皮毛中, 是毛发、角、爪、蹄的重要组成成分。动物角蛋白对动物起保护作用, 可用于饲料和食品以及肥料的加工, 也可用于制药和化妆品行业[1].随着近年来研究的深入, 人们发现角蛋白是植物细胞中间纤维的主要成分, 它们与细胞分化、信号传导、基因调控等重要生命活动相关, 但只有克隆到植物角蛋白基因, 才能为进一步研究植物角蛋白以及它的生物学功能打下基础。早在1990年, 苏菲[2]等人对植物叶肉原生质体进行选择性分级抽提, 应用整装制样技术, 首次清晰地显示玉米与烟草叶肉细胞中存在直径10nm的纤维构成的精细网络体系, 并用免疫胶体金标记技术进一步证明这些纤维的主要成分类似于动物细胞的角蛋白。赵大中[3]等人以拟南芥为材料, 以动物IF基因的保守序列为引物, 克隆到一个cDNA片段。随后在2000年又以胡萝卜悬浮培养细胞为材料, 纯化了两种类IF蛋白, 对其部分氨基酸序列进行了分析;同时以动物IF基因的一段保守序列为引物, 利用RT-PCR技术克隆到一个相关的cDNA片段[4].
  
  近年来随着功能基因组学研究不断深入及其相关技术不断完善, 植物的耐盐分子机制研究有了许多新的进展, 特别是盐胁迫信号转导途径和耐盐基因的鉴定、克隆及其功能分析等方面。柯丹霞等人将大豆WRKY6转入百脉根中显着提高了百脉根的抗盐能力[5].金太成等人利用沙打旺AH1基因的遗传转化使得转基因紫花苜蓿植株累积了大量的游离脯氨酸和可溶糖, 从而改良了紫花苜蓿耐盐性[6].水稻OsAPX1基因在烟草中的表达提高烟草的抗H2O2毒害的能力[7].
  
  甜高粱 (sweet sorghum) 是粒用高粱[Sorghum bicolor (L.) Mocnch]的一个变种, 环境恶劣的非洲大陆是甜高粱起源的地方, 为适应环境, 长期的进化使得甜高粱具备了耐旱、耐涝和耐盐碱等多重抗性[8,9,10].对这些优良的特性进行研究有利于我们对其他作物进行基因改造, 获得耐胁迫性的作物。研究甜高粱的耐盐机制对于培育出耐盐作物具有重要的指导作用。到目前为止, 对植物角蛋白基因的功能研究尤其是在抗逆方面的研究少之又少。因此本文对转甜高粱角蛋白HTV基因的拟南芥的抗盐能力进行了初步的探索与研究。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 植物材料与试剂
  
  甜高粱耐盐自交系M-81E种子, 烟草 (本生烟) 种子, 大肠杆菌菌株 (DH5α) , 农杆菌菌株 (GV3101) , 克隆载体pEASY-Blunt3simple, CaMV35S启动子驱动的pROKII-GFP表达载体等。反转录试剂盒 (Code:FSQ-101) 购自华越洋生物科技有限公司, RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒胶回收试剂盒等均购自天根生化科技有限公司。
  
  1.2 试验方法
  
  1.2.1 基因的克隆。
  
  将沙培的长至三叶一心时期的高粱根部取材, 提其RNA进行PCR扩增, 然后将得到的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带以获取基因的全长。参考SbHTV基因的cDNA序列Gene ID:8055395) 设计引物, 引物序列如:HTV-F:5'-GCGGATCCATGAATAACGGTTTCGCG-3';HTV-R:5'-GGGGTACC-TCAGAGCTTGTCGACGTCG-3'.
  
  1.2.2 甜高粱HTV基因在不同盐处理下的表达水平。
  
  将沙培的长至三叶一心时期的高粱用0mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM NaCl溶液处理48h, 取其根和叶提取RNA, 以反转录的cDNA为模板。从NCBI或甜高粱网站上根据基因号找到甜高粱的基因序列, 根据其cDNA序列用Beacon Designer 7软件设计定量引物, 内参引物我们选用甜高粱的β-actin基因。引物序如下。
  
  1.2.3 生物信息学分析。
  
  利用NCBI数据库和生物信息学以及DNAMAN, MEGA 5.0等软件对SbHTV基因进行同源性及进化分析。
  
  1.2.4 拟南芥过表达植株的获得。
  
  将1.2.1得到的目的条带进行测序, 并将测序结果与SbHTV序列进行比对, 比对结果无误后, 将目的条带与pEASY-Blunt3Vector进行连接并转化大肠杆菌5α。37℃培养12h后进行菌落PCR, 然后挑选阳性克隆进行培养, 对测序正确的菌液进行质粒的提取。用限制性内切酶BamHI和KpnI将质粒和表达载体pROKII-GFP双酶切之后再连接, 然后转化大肠杆菌5α, 将测序正确的阳性克隆提取质粒, 再将质粒转入农杆菌GV3101, 用含有SbHTV的农杆菌菌液侵染野生型的拟南芥, 将收的种子在含有卡那抗性的1/2MS培养基上筛选, 筛选三代之后获得纯合的拟南芥过表达植株。
  
  1.2.5 拟南芥纯合突变体植株的获得。
  
  在TAIR网站上找到纯合的突变体 (ATRLP51-2、SALK_049752) , 把买到的突变体通过CTAB小量法提基因组DNA, 用三引物法进行鉴定, 确定买到的突变体确实是纯合的。
  
  1.2.6 Real-time PCR分析。
  
  以野生型, 过表达植株, 突变体植株的RNA为模板, 用设计的qPCR特异性引物对基因的表达进行定量分析。利用拟南芥Actin2基因的引物作为内参[11], 引物序列同1.2.2.
  
  1.2.7 亚细胞定位分析。
  
  采用农杆菌注射渗透法[12]将已活化后的含有SbHTV基因的农杆菌注射到烟草的下表皮, 正常培养两天后在双光子共聚焦显微镜下观察烟草下表皮的绿色荧光的表达情况。
  
  1.2.8 种子萌发率与主根长度的测定。
  
  将消毒的野生型、过表达株系、突变体株系的种子成排点播于含有0、50、100和150mM NaCl的1/2MS培养基中, 春化3d后放到组培室培养, 24h后统计萌发率。萌发率= (萌发的种子个数÷种子的总个数) ×100%, 生长7d后进行主根长度的测量。
  
  1.2.9 生物量的测定。
  
  将拟南芥野生型、过表达、突变体株系的幼苗植株分别用0, 100mM NaCl处理10d, 然后将幼苗从营养土中取出, 并用去离子水将材料冲洗干净, 擦干植株表面的水分。称取植株的鲜重 (Fresh weight) , 然后放入70℃的烘箱中直至烘干, 称干重 (Dry weight) .每种处理6个重复。
  
  2 结果与分析
  
  2.1 基因的克隆及序列分析
  
  用引物扩增SbHTV基因, 目的条带大小为1926bp.从NCBI上对SbHTV基因的蛋白序列进行BLAST, 然后对这些序列进行进化分析可得知与甜高粱SbHTV基因亲缘关系最近的是短柄稻LOC102711408基因, 其次是籼稻的I_07775基因, 而甜高粱SbHTV基因与拟南芥AXX17_AT5G64180基因的亲缘关系相对于其他物种来说较远。通过SbHTV蛋白与其他物种的同源蛋白比对分析, 发现他们在比较保守的大约150个氨基酸内同源性比较高。
  
  图1 甜高粱SbHTV蛋白与其他物种的同源蛋白的比对及进化树分析

 
  2.2 SbHTV基因在不同盐浓度处理下的表达分析
  
  如图2所示, 无论是地上部分还是地下部分, 在50mM NaCl处理时, 甜高粱HTV基因的表达量显着上升。而100mM NaCl处理时, SbHTV的表达量显着下降, 当NaCl浓度为200mM时, SbHTV的表达量最低。表明该基因的表达受盐胁迫的诱导。
  
  图2 SbHTV基因在叶片和根中的表达量分析

  
  2.3 SbHTV蛋白的亚细胞定位分析
  
  在显微镜下可以明显的观察到转pROKⅡ-GFP空载体的烟草表皮细胞的绿色荧光信号分布在细胞核、细胞膜等几乎整个细胞, 在细胞质中也有, 但不是太明显。而带有目的基因的表达载体转到烟草后发现, 在下表皮细胞的绿色荧光信号几乎只分布在细胞核。
  
  图3 SbHTV蛋白的亚细胞定位分析

  
  2.4 拟南芥过表达纯合植株及突变体的Real-time PCR分析
  
  从图4可以看出过表达拟南芥株系的SbHTV的转录水平较野生型都显着提高, 由此可以充分证明SbHTV已成功转入到野生型拟南芥植株中。其次, 过表达植株OE6, OE12, OE21中SbHTV的转录水平相对较高, 而OE1, OE3, OE11次之, 因此我们选择OE6, OE12, OE21进行后期生理指标的验证。从图4可以看出拟南芥突变体株系 (htv-1和htv-2) 中与SbHTV的同源的基因的转录水平较野生型都显着下降。
  
  图4 过表达植株和突变体拟南芥中HTV的转录水平检测

  
  2.5 盐胁迫对野生型和转基因植株萌发率与主根的影响
  
  如图5 (A) 所示, 未用NaCl处理时, 野生型, 过表达和突变体种子的萌发率无显着性差异。随着盐处理浓度的升高, 各个株系的种子萌发率均显着下降。当用50、100、150mM NaCl处理时, 发现突变体株系的萌发率显着高于野生型拟南芥, 而过表达株系的萌发率显着低于野生型。这说明在萌发期, 突变体株系较野生型有较强的抗盐能力, 而过表达株系比野生型的抗盐能力弱。
  
  如图5 (B) , 7d后测量各个株系的根长发现, 在0mM NaCl处理时, 野生型拟南芥, 过表达以及突变体株系的根长无明显差异。随着盐浓度的升高, 各个株系的根长都显着下降。当用50, 100, 150mM NaCl处理时, 拟南芥各个株系的根长都出现了显着差异, 突变体的根长要显着长于野生型, 过表达株系的根长要显着小于野生型。
  
  图5 盐处理条件下, 野生型、过表达和突变体种子萌发率及根长的变化

  
  2.6 干鲜重
  
  图6可以看出, 100mM NaCl处理后, 拟南芥各株系的干鲜重均显着下降, 但过表达株系的下降程度显着高于野生型, 而突变体株系的下降程度要显着低于野生型。这些生物量的数据变化说明, 盐处理对突变体株系的生物量积累的抑制程度明显低于野生型, 而过表达株系受抑制的程度要明显高于野生型。
  
  图6 盐处理条件下, 野生型、过表达和突变体植株干、鲜重的变化

  
  3 讨论
  
  盐胁迫是对植物尤其是农作物的生长发育产生较大影响的一类非生物胁迫因子, 研究一些农作物耐盐基因的表达及功能, 一方面可以揭示农作物的耐盐机理, 另一方面还可以提高农作物的耐盐性[13].姜志磊等人通过在烟草中过表达玉米ZmHKT1与ZmHKT5基因, 验证该基因具有提高植物耐盐性的作用[14], 姚新转等人将高粱钠离子转运蛋白基因SbSKC1基因在烟草中过表达能够提高烟草的抗盐性[15].本试验通过在拟南芥中过表达SbHTV基因并利用拟南芥同源基因突变体, 验证了该基因具有负调控植物耐盐性的作用。我们通过对甜高粱HTV基因的研究发现该基因的CDS序列有1926个碱基, 可以编码641个氨基酸。通过甜高粱HTV氨基酸序列与其他物种的同源蛋白序列进行比较, 发现其与短柄稻的亲缘关系最近。通过对甜高粱HTV基因在不同盐浓度处理下的表达量进行了分析, 发现用100mM NaCl处理时, SbHTV的表达量开始显着下降, 且200mM NaCl处理时, SbHTV基因的表达量最低, 这说明甜高粱HTV基因是一个响应盐胁迫的基因。
  
  种子的萌发是植物生活史中最关键阶段之一, 受盐度的影响很大[16,17].研究发现, 对小麦施加中等程度的盐胁迫时会延缓它的发芽, 施加高强度的NaCl后会降低最终的发芽率[18].主根长度通常被用来衡量植物的抗盐能力。本研究发现无论是野生型植株、过表达植株还是突变体植株, 在高盐情况下的萌发率和主根长以及干鲜重相对于对照组来说都显着降低, 但很明显, 突变体的萌发率最高, 过表达植株的萌发率最低。这说明甜高粱SbHTV基因在植物抗盐过程中发挥着重要作用, 该基因的过量表达能够提高转基因拟南芥的盐敏感性。
  
  参考文献
  
  [1]李芳莹。羽毛角蛋白的高效提取及其在可控释放材料中的应用[D].兰州:西北师范大学, 2010.  
  [2]苏菲, 顾伟, 翟中和。植物叶肉细胞的类角蛋白中间纤维[J].中国科学, 1990 (3) :267-270.  
  [3]赵大中, 陈丹英, 陈敏, 等。拟南芥细胞中存在中间纤维的研究[J].植物学报 (英文版) , 1999, 41 (8) :795-799.
  [4]赵大中, 陈丹英, 杨澄, 等。植物细胞类角蛋白的纯化、序列分析与类中间纤维cDNA的克隆[J].中国科学:生命科学, 2000, 30 (3) :316-321.  
  [5]柯丹霞, 彭昆鹏, 夏远君, 等。盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析[J].草业学报, 2018, 27, 157 (08) :98-109.  
  [6]金太成, 孟大伟, 王悦, 等。利用AH1基因的遗传转化改良紫花苜蓿耐盐性[J].分子植物育种官方网站, 2016, 14 (12) :1724-1729.
  [7]管清杰, 罗秋香, 夏德习, 等。水稻OsAPX1基因在烟草中的表达及其抗盐性研究[J].分子植物育种, 2007 (1) :1-7.
  [8]Steduto P, Katerji N, Puetos-Molina H, et al.Water-use efficiency of sweet sorghum under water stress conditions Gas-exchange investigations at leaf and canopy scales[J].Field Crops Research, 1997, 54 (2-3) :221-234.  
  [9]Almodares A, Hadi M R, Kholdebarin B, et al.The response of sweet sorghum cultivars to salt stress and accumulation of Na+, Cl-and K+ions in relation to salinity[J].Journal of Environmental Biology, 2014, 35 (4) :733-739.
  [10]Xie T, Su P.Canopy and leaf photosynthetic characteristics and water use efficiency of sweet sorghum under drought stress[J].Russian Journal of Plant Physiology, 2012, 59 (2) :224-234.  
  [11]Han G, Wang M, Yuan F, et al.The CCCH zinc finger protein gene AtZFP1, improves salt resistance in Arabidopsis thaliana[J].Plant Molecular Biology, 2014, 86 (3) :237-253.
  [12]黎茵。农杆菌注射渗透法转化烟草实验研究[J].实验技术与管理, 2010, 27 (11) :50-52.  
  [13]王为, 潘宗瑾, 潘群斌。作物耐盐性状研究进展[J].江西农业学报, 2009, 21 (2) :30-33.  
  [14]姜志磊, 刘艳芝, 韦正乙, 等。玉米耐盐基因ZmHKT1;5在烟草中的功能验证[J].玉米科学, 2017 (5) :32-39.  
  [15]姚新转, 刘洋, 赵德刚。高粱Na+转运蛋白基因SbSKC1的克隆及其在烟草中的抗盐功能鉴定[J].作物学报, 2017, 43 (2) :190-200.
  [16]Rahman S, Matsumuro T, Miyake H, et al.Salinity-induced ultrastructural alterations in leaf cells of rice (Oryza sativa L.) [J].Plant Production Science, 2000, 3 (4) :422-429.  
  [17]Misra N, Dwivedi UN.Genotypic difference in salinity tolerance of green gram cultivars[J].Plant Science, 2004, 166 (5) :1135-1142.  
  [18]Almansouri M, Kinet J M, Lutts S.Effect of salt and osmotic stresses on germination in durum wheat (Triticum durum Desf.) [J].Plant&Soil, 2001, 231 (2) :243-254.
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