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层积过程中珙桐种仁和种壳抑制物活性的变化

添加时间:2016-11-02 15:02 来源:南京林业大学学报 作者:钱存梦 江周 周健 代
摘要
  珙桐(Davidia involucrata)是第三纪热带植物区系孑遗植物,为我国特有的珍稀濒危植物,被列为国家一级保护植物。珙桐树形优美,花姿奇特,似展翅飞翔的白鸽,因而被西方植物学家称为“中国鸽子树”,是着名的园林绿化树种,具有很高的观赏价值。珙桐常被植于池畔、溪旁及展览馆附近,并具有和平的象征意义。珙桐的材质沉重,是建筑的上等用材,可制作家具和作雕刻材料。
  
  目前,珙桐主要是采用种子繁殖。以往对珙桐种子休眠机理的研究发现,它具有隔年萌发现象,且坚硬而厚实的果核壁使其有不透气、透水,对种子萌发起到明显的抑制作用,另外,其胚的形态后熟是加重种子休眠特性的又一重要原因[1].雷泞菲等[2]的研究显示,珙桐果实中存在着大量的萌发抑制物,这可能也是引起种子休眠的一个重要原因。由于抑制物含量的多少会影响到种子的休眠程度,并且不同种类的抑制物在不同提取剂中的溶解性存在差异,因此笔者采用甲醇和丙酮2种提取剂,分别对层积过程中珙桐种仁和种壳抑制物活性的变化进行研究,以进一步探讨内源抑制物对珙桐种子休眠的影响,为生产实践中更好地解除其休眠提供理论依据。
  
  1材料与方法
  
  1.1试验材料及处理
  
  供试材料为2013年秋天从湖北恩施购买已低温层积12个月的珙桐种子,处理方法是:将种子与湿润细沙(湿度以手握成团,松开即散为宜)按体积比1:3混匀,放入塑料框内,在0~5℃冷库中放置12个月,定期翻动种子以使其保持良好的通气条件。将购买的种子分成两份,一份直接进行下面1.2.2的实验,另一份种子与湿沙按1:3的比例混合后在变温(白天15℃,8h;夜间5℃,16h)条件下层积4个月,层积期间使基质保持湿润。
  
  1.2试验方法
  
  1.2.1提取剂对白菜籽发芽影响的测定
  
  试验主要采用甲醇和丙酮作为提取剂。试验前先验证这两种提取剂自身对白菜籽发芽的影响。提取剂蒸馏液制备方法见文献[3],减压蒸馏温度调整为甲醇60℃,丙酮50℃。蒸馏结束后用白菜籽测定蒸馏液中抑制物的活性,即:随机抽取供试白菜种子100粒×3重复,用上述蒸馏液浸种3  h,对照用清水浸种相同时间。浸种后将试验材料置于25℃光照培养箱中进行发芽试验,白天给予8 h光照。当胚根伸长至1 cm时即认为此粒种子已发芽,每8 h统计该时间段种子的萌发粒数以及萌发所需要的时间,发芽时间以天为单位。当连续3 d每天的发芽率不超过重复粒数1%时即认为发芽结束[5].最后按下式计算发芽率和发芽指数,其中发芽指数计算时各处理的结束时间与对照的结束时间相同。
  
  发芽率=(发芽种子总数/供试种子总数)×100%
  
  发芽指数=∑(Gt/Dt),其中,Dt指发芽天数,Gt指与Dt相对应的时间点正常发芽种子数[4].
  
  1.2.2珙桐种壳和种仁浸提液的制备
  
  1)甲醇浸提液的制备。层积结束后随机抽取供试种子,横向锯开,将种壳、种仁分开,层积12个月的供试种壳、种仁需在液氮中速冻后放入-70℃超低温冰箱密封保存4个月。层积不同时间的种子取样结束后,用千分之一天平分别称取5g种仁、种壳,其中种仁用研钵磨碎,种壳用粉碎机粉碎,使用80%甲醇分别浸提种壳、种仁中的抑制物。具体为:将试验材料置于锥形瓶中加入约40 m L 80%的甲醇溶液,用保鲜膜封口,置于5℃冰箱中浸提24 h,浸提液过滤后再向锥形瓶中加入40 m L甲醇溶液,如此连续浸提3次,最后将3次浸提液合并。再在60℃下减压蒸除甲醇。蒸馏结束后加入蒸馏水定容至20 m L,调节蒸馏剩余物质的质量浓度为0.25g/m L(每m L溶液所含浸提物的质量为0.25g)待用。最后将种壳的浸提液分别稀释到0.2、0.1、0.05g/m L;种仁的浸提液稀释到0.09、0.06、0.03g/m L,置于5℃冰箱中密封保存。
  
  2)丙酮浸提液的制备。参照甲醇浸提液制备的方法,丙酮易挥发,只需在50℃下减压蒸馏即可。
  
  1.2.3种壳和种仁浸提液抑制物活性测定
  
  随机抽取市售白菜种子分别采用上述稀释后的浸提液浸种3 h,对照用清水浸种相同时间。浸种后将试验材料置于光照培养箱中进行发芽试验,取样数量、发芽条件及发芽率、发芽指数的计算同1.2.1.
  
  1.3数据统计分析
  
  统计各处理的发芽率、发芽指数,采用Excel和SPSS 19.0程序对测定数据进行统计分析。
  
  2结果与分析
  
  2.1提取剂自身对白菜籽发芽的影响
  
  各提取剂自身对白菜籽发芽的影响结果表明(表1):采用80%甲醇或丙酮蒸馏后的剩余液处理时,白菜籽的发芽率和发芽指数与对照组均无显着差异。因此,蒸馏后提取剂已被彻底蒸除,提取剂自身对白菜籽的发芽没有抑制作用。
  
 提取剂对白菜籽发芽率和发芽指数的影响
  
  2.2珙桐种子不同浸提液中抑制物活性的差异
  
  以甲醇作为提取剂,层积12个月后珙桐种仁与种壳中的浸提液对白菜籽发芽的影响见表2.当种仁浸提液质量浓度为0.03 g/m L时,对白菜籽发芽率的影响较对照组无显着差异,但发芽指数(30.6)与对照组(46.8)相比差异显着;随着浸提液浓度的增加,白菜籽发芽率和发芽指数均呈现递减趋势;浸提液质量浓度为0.09  g/m L时,白菜籽的发芽率和发芽指数均为0.种壳浸提液中抑制物的活性同样随着浸提液浓度的增加而显着增强,当质量浓度为0.10和0.05  g/m L时,浸提液对白菜籽发芽率的影响不显着,而发芽指数显着下降;当质量浓度为0.20  g/m L时,种壳浸提液显着降低了白菜籽的发芽率和发芽指数。此次试验结果表明:珙桐种仁与种壳中均存在发芽抑制物质,并且随着浸提液浓度的增加,抑制作用显着增强。
  
  以丙酮作为提取剂时,随着浸提液浓度的增加其抑制物的活性同样呈增强的趋势。不同的是,当种仁浸提液质量浓度为0.03  g/m L时,其对白菜籽发芽率和发芽指数的影响均不显着,当质量浓度增加至0.06  g/m L时,白菜籽的发芽率由对照组的95.3%下降到72.3%,同时发芽指数也由对照的46.8下降到21.1.
  
  由表2还可以看出:在相同的浓度下,种仁甲醇浸提液的抑制作用明显高于丙酮浸提液,如当浸提液质量浓度为0.06 g/m L时,采用甲醇浸提液处理后白菜籽的发芽率和发芽指数分别为45.0%和8.3,显着低于丙酮浸提液处理后的结果,分别是72.3%和21.1,因此种仁甲醇浸提液中抑制物的活性强于丙酮。而对于种壳浸提液,在3个浓度梯度下,2种浸提液对白菜籽发芽率、发芽指数的影响均无显着差异,说明甲醇和丙酮对种壳中抑制物的浸提效果差异不大。
  
  2.3不同部位浸提液抑制物活性比较
  
  仍以低温层积12个月的珙桐种子为例,采用相同的提取剂时,不同部位中抑制物的活性也有一定差异,如种仁和种壳的甲醇浸提液对白菜籽发芽的影响存在显着差异(表2)。当种仁浸提液质量浓度为0.09g/m L时,白菜籽的发芽率和发芽指数均为0;而种壳浸提液质量浓度为0.10 g/m L时,白菜籽的发芽率为89.7%,发芽指数为29.2.以丙酮作为提取剂时,种仁和种壳浸提液中抑制物活性的差异与上述甲醇浸提液的结果一致(表2)。以上结果表明,无论是以甲醇还是丙酮作为提取剂,均是种仁浸提液中抑制物的活性要明显强于种壳,也就是说珙桐种仁中抑制物质的含量比种壳中多。
  
   层积12个月后种子不同浸提液对白菜籽发芽的影响
  
  2.4层积不同时间的珙桐种子甲醇浸提液抑制活性比较
  
  分别层积12个月和16个月的珙桐种子,其种仁与种壳的甲醇浸提液对白菜籽发芽的影响见表3.经12个月的低温层积后,0.09 g/m L种仁浸提液处理的白菜籽均不能正常萌发,而再经过4个月变温层积后的珙桐种子,其种仁浸提液处理的白菜籽发芽率已达到90.3%(与对照组差异不显着),较变温层积前白菜籽的发芽率显着提高,但其发芽指数(33.3)仍显着低于对照组(46.8)。而层积16个月时,种壳甲醇浸提液(0.20g/m L)处理的白菜籽发芽率和发芽指数比层积12个月时均显着提高,其中发芽率由12.3%增加到94.0%,发芽指数由2.3增加到46.0,与对照组已无显着差异。以上结果表明:低温层积12个月后再经过4个月的变温层积,珙桐种仁与种壳浸提液中抑制物的活性较层积12个月时均呈显着降低的趋势,并且此时种壳中抑制物的含量很低,对白菜种子的萌发不再有抑制作用(发芽率和发芽指数与对照差异均不显着),但种仁中仍含有少量的抑制物,使白菜籽的发芽速度有一定的减缓(发芽指数较对照显着下降)。
  
  层积不同时间的珙桐种子甲醇提取液对白菜籽发芽的影响
  
  3讨 论
  
  3.1内源抑制物与种子休眠
  
  自然界中许多植物如红松、红豆杉、核桃、北五味子、野鸦椿、刺楸、黄连木等种子都含有内源抑制物质。许多野生植物种子的内源抑制物质在一定程度上与其种子的休眠有关,有的是造成种子休眠的根本原因,有的通过间接作用引起休眠[6].澳大利亚高山生长的有些桉树,种皮中存在化学抑制物质,使其种子发芽率低而且不规律,低温层积2~6周可以有效破除这种休眠[7].Del  Tredici等[8]对外来香蕨木种子的研究发现,引起休眠的抑制物质主要分布于种壳中,去除种皮和果皮可以使发芽率从对照的0%提高到71%.此次研究结果显示,珙桐种子层积12个月后其种仁和种壳中仍含有大量的内源抑制物,对白菜籽的发芽具有很强的抑制性,并且随着浸提液浓度的提高,抑制物生理活性逐渐增强。因此,珙桐种子的内源抑制物是引起其休眠的一个重要原因,这与陈坤荣[9]和雷泞菲[2]对珙桐种子休眠原因的研究结果一致。
  
  层积处理往往是打破种子休眠的有效方法,对因含抑制物而导致生理休眠的种子其效果更为显着,同时也可有效解除物理休眠[10-11].这主要是由于层积能够软化种皮,增加种子的透气、透水性,使胚萌发所需的酶、激素、可溶性代谢物质以及其他化合物达到足够的水平[12-14].该研究结果表明,低温层积12个月的珙桐种子中仍有大量的内源抑制物,再继续变温层积4个月后,种仁与种壳中内源抑制物的活性显着降低,但此时种仁浸提液处理后白菜籽的发芽指数仍显着低于对照,因此其种仁中仍含有一定量的发芽抑制物。
  
  3.2不同提取剂对抑制物浸提效果的影响
  
  许多研究指出,种子休眠可能是由于在种子中存在着抑制物,如脱落酸(ABA)、酚类的水杨酸、苯氧酸、有机酸和生物碱等[15-17].种子中的内源抑制物极易溶于极性溶剂甲醇、丙酮等[6],因此常利用这一特性来浸提种子的内源抑制物。但是由于有机溶剂极性的差异,采用不同的提取剂所浸提的抑制物的种类和含量都会存在差异[18].有研究表明,甲醇分离相中含有乙酸、苯酚等多种抑制物质,乙醚分离相所含酚类物质中也包含香草酸、香豆酸等,水相中存在酸性物质成分[19],丙酮作为提取剂时可兼顾水溶性和脂溶性成分[20].该研究表明,采用甲醇和丙酮作为提取剂时,在相同的浓度下,种仁甲醇浸提液中抑制物的活性显着高于丙酮浸提液,而种壳中2种提取剂的抑制作用差异并不显着。说明珙桐种仁中有更多的抑制物溶于甲醇中,可能是种仁中含有较多的乙酸、苯酚等抑制物,而种壳内的抑制物成分在2种溶剂中的溶解性相当。珙桐种子中内源抑制物的种类、含量仍没有具体报道,有必要进一步开展相关研究进行验证。
  
  3.3抑制物在珙桐种子中的分布
  
  自然界中许多植物的种子都存在发芽抑制物,但内源抑制物在种子中分布的位置因植物种类的差异而有所不同[21].如青钱柳的抑制物主要分布于外种皮上[22],南方红豆杉[23]和三角槭[24]主要分布于种胚中,乌桕主要分布于胚乳及种皮中[25],珊瑚朴分布于果皮和种胚中[26],而红松种子的外种皮、内种皮、胚乳和胚中均有抑制物质的存在[27].本研究结果表明,珙桐种子的种仁和种壳中均存在发芽抑制物质,但种仁浸提液中抑制物的活性显着高于种壳浸提液,说明种仁中抑制物的含量显着高于种壳。
  
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